外顯子占據人類基因組約2%，包含合成蛋白質所需要的重要信息。其可編碼區(qū)的變異認為與單基因遺傳病和部分復雜疾病有很密切關系。而且與全基因組重測序相比，外顯子組測序只針對外顯子區(qū)域，可以用較小的數據量獲得更可靠的分析結果，性價比極高。我們將試劑盒捕獲的外顯子區(qū)域經過深度測序得到高質量數據，再利用優(yōu)化后的算法快速有效的找到候選位點幫助您更深入探究疾病和變異的內在聯(lián)系。
技術線路：
樣本準備：
（1）樣品純度：OD 260/280值應在1.8～2.0 之間; RNA應去除干凈。
（2）樣品濃度：最低濃度不低于50ng/μl。
（3）樣品總量：Agilent至少5ug；Nimblegene&illumina至少3ug。
（4）樣品保存：保存在H20或TE (pH 8.0)中。
（5）樣品運輸：冰袋運輸，且在運輸過程中請用parafilm將管口密封好，以防出現污染。
（6）全血樣本：1ml, EDTA抗凝,冰袋運輸。
（7）建議在條件允許情況下，提供可供兩次樣品配備的量，以確保實驗質量及延續(xù)性。
數據分析：
應用案例：
1. 課題組在國際上首次確定了POFUT1基因為泛發(fā)性屈側網狀色素異常的致病基因，并證實該基因在黑素合成和轉運方面發(fā)揮重要作用。
2. 課題組首次揭示了POFUT1基因以及Notch信號通路在人類黑素合成與轉運的作用，為疾病的分子診斷、預防與治療，以及探索人類色素性疾病的發(fā)病機制奠定了基礎。
研究方法：
1. 采集DDD家系血樣并抽提DNA；
2. 利用Linkage SNP芯片進行家系的連鎖分析，找出疾病的候選區(qū)域；
3. 運用全外顯子測序手段，篩選得到兩個候選基因；
4. 通過Sanger測序對兩個家系樣本進行驗證，最終鎖定POFUT1為致病基因；
5. 構建敲除POFUT1基因的斑馬魚模型，揭示pofut1基因對黑素合成與轉運的重要作用。
結果分析：
1．為了確定泛發(fā)性褶皺部網狀色素異常（DDD）致病基因的候選基因，課題組對家系1中的14名成員進行芯片實驗，通過家系連鎖分析找出候選基因區(qū)域。
Fig3A. Haplotype analysis of family 1. Haplotype indicates heterozygosity between rs1293713 and rs244123 in affected family members. The recombination events defined the susceptibility region in 20p11.21–20q13.12 to a 14.79 cM interval. Red bars indicate the chromosomal region shared by affectedmembers of the pedigree.
2. 將高通量測序篩選到的候選位點進行Sanger測序驗證，最終找到在兩個家系中共有的致病基因POFUT1。
Fig3(C and D). POFUT1 mutations in the two families: c.430G>T (p.Glu144*) in family 1 (C) and c.482delA (p.Lys161Serfs*42) in family 2 (D). The black arrows indicate mutations.
3. 利用反義嗎啡啉基因沉默技術，成功構建了疾病的斑馬魚模型，充分驗證了pofut1基因對黑素合成與轉運的重要作用。
Fig4(C)
