ChIP—Seq
染色質(zhì)免疫共沉淀技術(shù)（Chromatin Immunoprecipitation，ChIP）也稱結(jié)合位點分析法，是研究體內(nèi)蛋白質(zhì)與DNA相互作用的有力工具，通常用于轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合位點或組蛋白特異性修飾位點的研究。將ChIP與第二代測序技術(shù)相結(jié)合的ChIP-Seq技術(shù)，能夠高效地在全基因組范圍內(nèi)檢測與組蛋白、轉(zhuǎn)錄因子等互作的DNA區(qū)段。
ChIP-Seq的原理是：首先通過染色質(zhì)免疫共沉淀技術(shù)（ChIP）特異性地富集目的蛋白結(jié)合的DNA片段，并對其進行純化與文庫構(gòu)建；然后對富集得到的DNA片段進行高通量測序。研究人員通過將獲得的數(shù)百萬條序列標簽定位到基因組上，從而獲得全基因組范圍內(nèi)與組蛋白、轉(zhuǎn)錄因子等互作的DNA區(qū)段信息。基于此，我們推出ChIP-Seq的完整解決方案，協(xié)助您一起探索生物奧秘。
技術(shù)線路：
樣本準備：
（1）DNA純度：OD 260/280值應(yīng)在1.8～2.0 之間;
（2）DNA總量：每個樣品總量不少于15ng；
（3）DNA的保存溶劑：H2O 或TE (pH 8.0)中；
（4）樣品運輸：冰袋運輸，且在運輸過程中請用parafilm將管口密封好，以防出現(xiàn)污染；
（5）建議在條件允許情況下，提供可供兩次樣品制備的量，以確保實驗質(zhì)量及延續(xù)性。
數(shù)據(jù)分析：
應(yīng)用案例：
研究背景：
1.控制大多數(shù)哺乳動物發(fā)育的轉(zhuǎn)錄因子可以控制細胞類型特異性模式的基因表達，通過高通量測序技術(shù)，在哺乳動物中鑒定出400,000至1.4 million個增強子，如：有特定的組蛋白修飾的增強子。
2.建立和維持胚胎干細胞（ESCs）動態(tài)的基因表達依賴于少數(shù)幾個主要轉(zhuǎn)錄因子，包括Oct4,Sox2,OSN(Nanog)等，與中間物復(fù)合體一起可以結(jié)合增強子，易于捕獲RNA聚合酶II來作用靶基因的啟動子區(qū)域。關(guān)于降低中間物水平可以模擬影響ESCs的Oct4水平的機制目前還不清楚。利用ChIP-seq技術(shù),發(fā)現(xiàn)超級增強子具有影響大多數(shù)哺乳動物細胞類型中有識別作用基因表達的功能。
研究方法：
1. 小鼠基因組DNA提取。
2. 極小量的Oct4 啟動子擴增，熒光素酶表達構(gòu)建。
3. 利用illumina平臺，進行ChIP-seq測序。
4. 數(shù)據(jù)分析。
分析結(jié)果：
1. 發(fā)現(xiàn)ESCs大量基因組結(jié)構(gòu)域被主要的轉(zhuǎn)錄因子和中間物占據(jù)。如下圖：展示了8794個ESC增強子集合中， H3K27ac, H3K4me1, DNaseI hypersensitivity, OSN正常的ChIP-seq 密度和信號分布圖。
2. 超級增強子通常與主要細胞識別基因有關(guān)。圖中顯示出轉(zhuǎn)錄因子ESCs的OSN; pro-B cells 的PU.1; 肌小管的MyoD; T-bet in Th（T helper）細胞; 巨噬細胞的C/EB Pa 分別在 Esrrb, Inpp5d, Myod1, Tcf7, and Thbs-1的位置關(guān)系，以及統(tǒng)計3種細胞類型（ES,Pro-B (murine progenitor B)的典型增強子相關(guān)基因與超級增強子相關(guān)基因的韋恩圖。
