分類：蛋白相關(guān)實驗 發(fā)布時間 閱讀： 622
ELISA實驗樣本收集與處理方法
（YOBIBIO ELISA代測說明）
Elisa方法被廣泛應(yīng)用于各種抗原和抗體測定。目的是為實驗提供準確可靠的定量分析的實驗依據(jù)。在Elisa測定中影響因素較多,在檢測過程中除正常反應(yīng)外,有時常見到一些錯誤的結(jié)果.為了保證實驗數(shù)據(jù)的可靠性， 在實驗過程中必須堅持全面和全程的質(zhì)量控制。在收集標本前需有一個完整的方案。
本篇為攸碧艾（YOBIBIO)結(jié)合文獻、科研成功經(jīng)驗及試劑盒說明書，整理的樣本收集與處理方法，供廣大科研工作者參考使用。
委托我公司進行ELISA實驗代測業(yè)務(wù)的，需依照本方法對樣本進行收集和處理。
一、樣本類型
1. 液體類標本：血清、血漿、尿液、胸腹水、腦脊液、細胞培養(yǎng)上清等。
2. 細胞沉淀、組織等
二、樣本保存
4℃保存：
對收集后當(dāng)天或次日進行檢測的樣本，儲存在 4 ℃ 備用。超過時間的需低溫保存。
-20 ℃ 或 -70 ℃保存：對于保存期限超過1天的樣本，在 -20 ℃ 或 -70 ℃ 條件下保存。如有特殊原因需要周期收集樣本， 將樣本及時分裝后放在 -20 ℃ 或 -70 ℃ 條件下保存。避免反復(fù)凍融。
一般情況下，標本 2 -8 ℃ 可保存 48 小時， -20 ℃下 可保存 1 個月。 -70 ℃下可保存 6 個月。
三、 樣本收集和處理
➢血清：室溫血液自然凝固 10-20 分鐘后，離心 20 分鐘左右（2000-3000 轉(zhuǎn)/ 分）。仔細收集上清。-20°C 或者-80°C 冷凍保存。
➢血漿：應(yīng)根據(jù)試劑盒的要求選擇 EDTA、檸檬酸鈉或肝素作為抗凝劑，抗凝血 離心 20 分鐘左右（2000-3000 轉(zhuǎn)/分）。仔細收集上清。-20°C 或者-80°C 冷凍保存。
➢尿液、胸腹水、腦脊液、肺泡灌洗液：用無菌管收集。離心 20 分鐘左右 （2000-3000 轉(zhuǎn)/分）。仔細收集上清。-20°C 或者-80°C 冷凍保存。
➢細胞培養(yǎng)上清：用于檢測分泌性的成分，用無菌管收集。離心 20 分鐘左右 （2000-3000 轉(zhuǎn)/分）。仔細收集上清。
➢細胞沉淀：用于檢測細胞內(nèi)的成分，用 PBS 稀釋細胞 懸液，細胞濃度達到 100 萬/ml 左右。通過反復(fù)凍融，以使細胞破壞并放出細 胞內(nèi)成份。離心 20 分鐘左右（2000-3000 轉(zhuǎn)/分）。仔細收集上清。-20°C 或 者-80°C 冷凍保存。
如代測時需我公司進行細胞沉淀樣本的處理，可將細胞沉淀樣本裝入1.5ml離心管郵寄至我公司（數(shù)量需至少肉眼可見），我公司在ELISA正式實驗前按上述方法處理樣本，收取20元/樣本的樣本處理費。
溫馨提示：為確保您得到準確的細胞內(nèi)成分數(shù)據(jù)，如樣本類型為細胞沉淀，建議您在完成上清收集后，進行BCA蛋白定量檢測并記錄，結(jié)合蛋白定量檢測結(jié)果和ELISA檢測結(jié)果，計算出細胞內(nèi)成分數(shù)據(jù)。如需我公司在ELISA檢測前進行BCA蛋白定量檢測，我公司按每80個樣本200元（不足80部分按80個計算）的標準收取費用。
➢組織標本：切割標本后，稱取重量。加入一定量的 PBS，用手工或勻漿器將標 本勻漿充分。離心 20 分鐘左右（2000-3000 轉(zhuǎn)/分）。仔細收集勻漿上清。-20°C 或者-80°C 冷凍保存。
如代測時需我公司進行組織樣本的處理，可將組織標本郵寄至我公司（至少黃豆粒大�。�，我公司在ELISA正式實驗前按上述方法處理樣本，收取20元/樣本的樣本處理費。
溫馨提示：為確保您得到準確的組織內(nèi)成分數(shù)據(jù)，如樣本類型為組織，建議您在完成上清收集后，進行BCA蛋白定量檢測并記錄，結(jié)合蛋白定量檢測結(jié)果和ELISA檢測結(jié)果，計算出組織內(nèi)成分數(shù)據(jù)。如需我公司在ELISA檢測前進行BCA蛋白定量檢測，我公司按每80個樣本300元（不足80部分按80個計算）的標準收取費用。
四、注意事項
1. 攸碧艾ELISA試劑盒單孔所需樣本量為約60ul，因此每個標本量收集體積＝約60ul ×檢測指標。如要做復(fù)孔，標本量收集體積＝約60ul ×檢測 指標×2 ，更多復(fù)孔以此類推。
2. 收集標本前必須清楚要檢測的成份是否足夠穩(wěn)定。以確定樣本保存溫度。保存條件參考樣本保存。
3. 血清標本采集時，應(yīng)注意避免溶血，紅細胞溶解時會釋放出具有過氧化物酶活性的物質(zhì)， 以 HRP 為標記的 ELISA 測定中，溶血標本可能會增加非特異性顯色。
4. 為了保證尿液檢測結(jié)果的準確性，必須正確收集尿液標本和保存。盛尿容器要清潔干燥。 最好使用一次性的容器（如塑料尿杯），避免因用藥并清洗不干凈而造成的污染，影響 檢測結(jié)果。尿液標本必須新鮮，留取后，應(yīng)及時檢測或保存，以免細菌繁殖。因在室溫 （尤其是夏季）中久置后尿中的磷酸鹽等可析出結(jié)晶而干擾檢測。
5. 凍結(jié)標本融解后，蛋白質(zhì)局部濃縮，分布不均，應(yīng)充分輕緩混勻，避免氣泡，可上下顛 倒混和，不要在混勻器上強烈振蕩。
6. 混濁或有沉淀的標本應(yīng)先離心或過濾，澄清后再檢測。
7. 反復(fù)凍融會使蛋白效價降低，所以待測標本如需保存作多次檢測，宜少量分裝冰存。也 可加入適當(dāng)防腐劑。
8. 激素類標本需添加抑肽酶。
全血樣本提取好了應(yīng)該及時離心血清或者血漿。并要求-70℃條件下保存，如果一個月左右可以開展實驗可以-20℃保存，期間不能反復(fù)凍融。
凍存后的全血不可以再提取血清、血漿樣本進行elisa實驗的具體原因如下：
1、全血凍存后解凍，用常規(guī)離心方式提取血清仍然是可以的，唯一不利的一點是，伴隨凍融的過程，會出現(xiàn)比較嚴重的溶血事件。而最后提取出來的血清能否做elisa，主要取決于溶血程度、所檢測目標蛋白的性質(zhì)及實驗的最終目的。
2、溶血釋放的胞內(nèi)組分往往容易影響本底，甚至出現(xiàn)假陽性；而蛋白酶的釋放可能導(dǎo)致目標蛋白的降解影響最終結(jié)果；目標蛋白的大小、穩(wěn)定性、特異性（相對抗體而言）又影響其自身與酶標板的吸附、與抗體的結(jié)合率及自身降解等。以上各種不確定性因素存在下，如果只是對血清中某種血清蛋白做定性檢測，可以得出相應(yīng)結(jié)果；若是定量分析，從可靠性的角度出發(fā)，不建議使用。
五、代測說明
1.活動期間，凡購買攸碧艾任意ELISA試劑盒，均提供對應(yīng)指標的免費代測一次。
2.單個指標，96T試劑盒最多檢測88個樣本，48T試劑盒最多檢測40個樣本（8個是標準品孔），請據(jù)此計算使用試劑盒的數(shù)量。
3.請務(wù)必仔細填寫“樣本收集表”。其中，樣本編號欄的編號必須與樣本實物上的編號一致。
4.樣本運輸：將樣本及時分裝后干冰運輸，確保放在-20℃或-70℃條件下保存。避免反復(fù)凍融。運輸時應(yīng)添加足夠量的干冰以覆蓋樣本，并考慮運輸過程中的干冰損耗，應(yīng)確保樣本到達我公司時仍有充足的干冰用以維持樣本溫度。干冰損耗可按1天損耗3kg計算。
5.收到樣本核對無誤后，2個工作日完成檢測并反饋結(jié)果，實驗數(shù)據(jù)以文件格式回復(fù)。
6.代測結(jié)束后，已開封試劑盒有效期為1個月，有效期內(nèi)我公司可代為保管未使用完的試劑盒，過期做報廢處理；也可在代測結(jié)束后將剩余試劑盒和樣本寄回客戶，質(zhì)保期為自開封日起1個月。
7.購買試劑盒贈送免費代測一次/盒，后續(xù)如客戶仍需使用剩余樣本孔進行代測，需收取300元/次代測費。
